Fundado em 25 de janeiro de 1640, por Frei Manoel de Santa Maria, o Convento de Santo Antônio do Valongo da Ordem dos Franciscanos teve o início de sua construção em 1º de junho de 1641. No dia 20 de outubro do mesmo ano fundou-se a Ordem Terceira de São Francisco, que veio a ter influência marcante na permanência dos Franciscanos no local. Em 1689 foi construída a capela da Ordem Terceira com arco aberto para a capela conventual.

No Século XVIII todo o conjunto arquitetônico destacou-se como um dos maiores e mais bonitos de toda a Província Franciscana no Brasil.

Por sua localização e tamanho, o Convento de Santo Antônio do Valongo escreveu parte da história da Igreja e da cidade. Foi sob seu teto que o primeiro bispo de Santos, Dom Bernardo Rodrigues Nogueira, organizou os primeiros passos da Diocese de São Paulo, que abrangia toda a região Sul do Brasil. Também ali foi acolhido por alguns dias o monsenhor João Mastai Ferretti, que a caminho do Chile ancorou no porto para reparos de sua nau. Anos mais tarde, Dom João foi eleito Papa, assumindo o nome de Pio IX (1846-1878). Em 1543 o Convento sediou a Santa Casa de Misericórdia, primeira instituição hospitalar das Américas.

No ano de 1859 uma série de contratempos acabaram por inscrever o Convento de Santo Antônio do Valongo como local de milagres no imaginário popular. Sob o guardianato de Frei Miguel de Santa Rita, eleito em 1859, a residência franciscana foi comprada pela Companhia São Paulo Railway. Era interesse do Barão de Mauá construir ali uma estação de trem da Estrada de Ferro Santos-Jundiaí. João Luiz Promessa, em "Reminiscências de Santos", conta que quando a "Inglesa" quis remover a imagem seiscentista de Santo Antônio para se apoderar da Igreja, não houve força humana capaz de fazê-lo. O fenômeno considerado como milagre obrigou os engenheiros a abandonarem seus projetos. Os fiéis reagiram ao atentado à imagem e munido de paus, ferramentas e armas impediram a demolição do templo. Interviram junto a D. Pedro II e por intercessão do Visconde de Embaré (Antônio Ferreira Júnior) a igreja foi salva.

De 1855 a 1906 funcionou no Convento a Escola de Meninas do Valongo, fundada por Mariana Amberguer e Maria Gertrudes Mayer. Mas foi somente em 1922 que os frades retornaram ao Valongo, quando frei Paulo Luig assumiu como guardião. Em agosto deste ano, a Arquidiocese de São Paulo criou a Paróquia de Santo Antônio do Valongo, abrangendo boa parte da cidade, do interior, e da Ilha de Santo Amaro, atual Guarujá, e da Região de Cubatão.

Em 1987, Dom David Picão, por decreto, transformou a Matriz do Valongo em Santuário.